Traduction de l’article 

Evaluation of the bactericidal activity on oral organisms of the Nd:YAP Laser in vitro  P Calas, T. Rochd, C. Roques. Lasers in Medical Science – 13:288-92 1998  

ROCHA Tarik, CALAS Paul`. ROQUES Christine’  

Laboratoire de Bactériologie, Virologie et Microbiologie industrielle Faculté des sciences Pharmaceutiques de Toulouse   Laboratoire interactions biomatériaux – tissus de soutien ; Faculté de Chirurgie Dentaire de Toulouse

 

Mots clés:  

laser ; endodontie ; antisepsie  

RÉSUME  

L’activité bactéricide d’un laser Nd-YAP, pulsé et à fibre, a été évaluée sur différentes souches buccales  Prevotella nigrescens, Sreptococcus sanguis, Actinomyces viscosus (i), Fusabacterium nucleatum.  Actinobacillus actinomycetemcomitans et Peptostreptococcus micros (i). Une fibre optique de 200 µm est  placée dans des tubes Eppendorf contenant les différentes suspensions bactériennes. A une puissance de 

170mJ130Hz, 350 impulsions d’une durée de 150 µs ont été suffisantes pour tuer les bactéries les plus  résistantes (i)_ Le temps opératoire est de 28 s. L’élévation de température provoquée par les tirs a été  ensuite mesurée in vitro à la surface des racines de deux groupes de 10 monoradiculées. Un groupe a reçu  350 impulsions ; pour l’autre le temps de préparation a été fixé à 28 s. L’élévation de température a été de  25,56°G pour le premier groupe et de 25,25°C pour le deuxième.  

INTRODUCTION  

Grâce au développement des fibres optiques les possibilités d’utilisation des lasers ont été étendues ces  dernières années à de nouveaux domaines. C’est le cas en Odontologie et plus particulièrement en  Endodontie pour les traitements canalaires. Des fibres de fin diamètre peuvent maintenant pénétrer sans problème dans les canaux jusqu’au foramen apical.  

Les lasers peuvent ainsi être utilisés lors de la préparation canalaire pour le nettoyage et la mise en forme  du canal. La pulpe est éliminée par vaporisation. Au niveau de la dentine l’ablation tissulaire est fonction de  la longueur d’onde, de l’énergie et de la localisation du faisceau. Un élargissement du canal et des  remaniements de surface caractérisés par la présence de zones de fusion dentinaire ont pu être observés  [1,2]. Quand la pulpe est nécrosée les micro-organismes colonisent l’espace canalaire (3]. Avec les  techniques classiques, irrigations per opératoires et médications temporaires, il est parfois difficile de les  éliminer en totalité [4]. L’utilisation des lasers a donc été préconisée pour traiter ces processus infectieux. L’effet  antibactérien a été largement prouvé avec les lasers C02 [5]. Cependant, leur utilisation ne peut être  envisagée dans la plupart des cas cliniques en endodontie du fait de l’absence de fibre optique. Les lasers pulsés et  fibrés Nd-YAG sont plus adaptés aux thérapeutiques endodontiques. Ainsi sur des espèces buccales,  WHITTERS et al. [6] obtiennent 99,9% de lyse bactérienne. SCHULTZ et al (7], RAGOT ROY et al (8],  recherchant un effet de photosensibilisation, ont étudié les effets conjugués de l’adjonction de colorants. La  présence d’encre de chine potentialise l’action du laser et permet d’obtenir un effet bactéricide. Cet effet peut être  étudié sur dents naturelles (9,10]. L’action du laser est alors évaluée par mise en culture des prélèvements  canalaires après traitement. D’autres supports ont aussi été utilisés : microplaques (8}, géloses [111. tubes  de verre ou de plastique [6]. C’est ce dernier type de support qui a été choisi pour tester l’action d’un  nouveau laser, Nd-YAP, puisé et à fibre, sur des bactéries représentatives de la population microbienne  des dents à pulpes nécrosées.  

Le but de ce travail est d’évaluer in vitro l’activité antibactérienne de ce laser en fonction de l’élévation de  température.  

Dans un deuxième temps l’élévation de température induite par ces thérapeutiques à la surface de la racine  est contrôlée sur dents naturelles.  

MATÉRIEL ET MÉTHODE  

Activité antibactérienne 

Une sélection de 6 souches bactériennes est retenue pour cette étude: Prevotella nigrescens NCTC 9336,  Streptococcus sanguis ATCC 10556, Actinomyces viscosus ATCC 15987, Fusobacterium nucleatum ATCC 25586, Actinobacillus actinomycetemcomitans ATCC 33384 et Peptostreptococcus micros (C. MOUTON 63  M).  

Après décongélation, les souches sont individuellement mises en culture sur gélose Columbia au sang  (Biomérieux, Crayonne, France) et incubées à 37°C. Il est procédé à trois repiquages. Quand les bactéries  sont en phase de croissance exponentielle, des suspensions ajustées à 10′ CFU (Colony Forming Units)/ml  sont préparées en eau distillée stérile pour chaque souche. Ces suspensions bactériennes sont réparties  dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml (Bioblock Scientific, Danbury, Con.) à raison de 50 NUtube. Toutes ces  opérations sont réalisées en respectant de strictes conditions d’anaérobiose, excepté pour A  actinomycetemcomitans dont l’incubation est effectuée sous atmosphère C02. Le laser testé est un laser pulsé  et à fibre optique de type Nd:YAP Lokki Dt (Lokki, Vienne, France).  

La matrice est constituée par un cristal synthétique ou Perovskite d’Yttrium et d’Aluminium et dopée d’ions  Néodyme. Sa longueur d’onde est de 1,34 µm et l’énergie utilisée est de 170mJ à 30Hz. La durée de  chaque impulsion est de 150 us. L’appareil utilisé pour cette étude a été équipé d’un compteur d’impulsions  temporisé à 0,5 sec. (Fig 1).  

 Lors des séries de tirs, une fibre de 200 µm est placée dans les différentes suspensions bactériennes et   l’irradiation est effectuée en utilisant une technique identique à celle utilisée par Whitters et al. (6j mais selon   un mode discontinu. La durée et le nombre des impulsions sont chaque fois enregistrés. L’élévation de  température provoquée par les tirs laser est enregistrée au moyen d’un thermocouple (FLUKE 51 K/J  Thermometer, Everett, Was., USA). L’extrémité de la sonde est placée au contact de la paroi du tube, au  niveau de la partie contenant la suspension. Sept niveaux de températures sont retenus : 35, 40, 45, 50, 55,  60 et 70°C. Les tirs sont arrêtés lorsque le seuil de température recherché est atteint. A partir de chaque  suspension 31 tubes sont préparés: 3 servent de témoin de viabilité des bactéries, les 28 autres sont répartis en  7 séries de 4 tubes. Chaque série de 4 tubes est affectée à un niveau de température différent.  

 Après irradiation, 10 ul de suspension sont prélevés et étalés sur une gélose Columbia au sang. Les boites   sont ensuite placées en incubation à 37°C sous atmosphère appropriée. La lecture des résultats est faite par   comptage des CFU après 48h d’incubation.  

Contrôle de l’élévation de température sur dents naturelles. 

Les canaux de 20 monoradiculées conservées dans du sérum physiologique à 4°C sont sélectionnés. Après  aménagement des voies d’accès coronaires, l’ampliation est effectuée de façon à ce qu’une fibre de 200 µm  puisse parvenir sans contrainte à l’extrémité apicale du canal.  

Les dents sont réparties, au hasard, en 2 groupes de 10. Dans le groupe 1 c’est le temps opératoire qui est  contrôlé et la durée de l’intervention est de 28 s. Dans le groupe 2 c’est le nombre d’impulsions et il  est procédé à un nombre de 350 impulsions par dent. La technique d’utilisation et les réglages du laser  sont identiques à ceux de l’expérimentation précédente.  

Pendant les tirs laser, l’extrémité de la fibre est régulièrement déplacée dans le canal sur toute sa longueur. Au cours  de ces irradiations la température est mesurée sur la surface externe de la racine. L’extrémité de ta sonde  du thermocouple (FLUKE 51 K/J Thermometer) est placée à la jonction du 113 médian et du 1/3  apical.  

RESULTATS  

Activité antibactérienne 

Les valeurs des CFU données pour chaque série correspondent à la moyenne des CFU des 4 tubes de la  série (Table 1). P nigrescens et S sanguis sont les souches les plus sensibles à l’action du laser. Elles ne  résistent pas à une irradiation de 194 impulsions pendant une durée moyenne de 16 s. La température de la  paroi externe du tube est alors de 40°C. Les autres souches testées se sont avérées aussi sensibles à  

l’action du laser. Un temps de préparation de 21 s avec un nombre moyen de 257 impulsions, est suffisant  pour provoquer l’élimination de F nucleatum et de A actinomycetemcomitans. Pour obtenir une destruction  complète des différentes bactéries testées, c’est à dire supérieure à 5 log, il est nécessaire d’effectuer une  irradiation canalaire de 351 impulsions en un temps opératoire moyen de 28 s. Dans ces conditions  d’irradiation, une température de 55°C est relevée à la surface du tube. C’est le seuil atteint pour parvenir  à la lyse complète des deux souches qui se sont avérées les plus résistantes, A viscosus et P micros.  

Contrôle de l’élévation de température sur dents naturelles 

(Table 2) 

La température moyenne mesurée à la surface de la dent est de 47,25°C quand la durée de l’irradiation est de  28 s (Groupe 1 ) et de 47,66°C avec une irradiation de 350 impulsions (Groupe 2). Ces mesures ont été  enregistrées alors que les échantillons étaient à température ambiante, soit à 22°C. Les élévations de température enregistrées à la surface de la dent sont donc de 25,25°C et de 25,66°C.  

DISCUSSION  

Les bactéries testées sont représentatives de la population bactérienne endocanalaire des dents à  pulpe nécrosée [4]. Les streptocoques et les bacilles à Gram négatif à pigmentation noire sont parmi les  espèces les plus fréquemment isolées des prélèvements endocanalaires.  

 P nigrescens est une bactérie au pouvoir pathogène élevé. 11 s’agit d’un bacille Gr négatif, anaérobie strict et à   pigmentation noire.  

Elle a longtemps été assimilée au genre P intermedia. Sa différenciation a été démontrée dans une étude  récente [12j. Elle est fréquemment impliquée dans les phénomènes inflammatoires péri-radiculaires évoluant  selon un mode aigu. Van Winkelhoff [13j ont isolé P intermedia dans 63% des canaux de dents présentant des  abcès d’origine endodontique.  

Dans les infections pulpaires compliquées de lésions péri-radiculaires, Actinomyces sp et Peptostreptococcus sp  jouent également un rôle primordial. Yoshida et al. [14j observent que les souches de Peptostretococcus sp  sont prépondérantes dans les infections apicales aiguës. Quant aux Actinomyces ils peuvent être impliqués  dans les échecs de traitement. Ils sont isolés de prélèvements péri-apicaux effectués en l’absence de  cicatrisation après traitement (15].  

 Fusobacterium est souvent isolé dans les prélèvements initiaux et se révèle difficile à éliminer car résistant aux  traitements conventionnels [4].  

 La technique utilisée a permis de traiter une suspension bactérienne en quantité déterminée. L’action du   laser est ainsi parfaitement contrôlée et la dose d’irradiation minimum inhibitrice facilement déterminée. La   quantité d’irradiation nécessaire pour provoquer une bactéricidie supérieure à 5 log est différente en  

 fonction des souches testées. Il faut 351 impulsions pour venir à bout des souches les plus résistantes A   viscosus et P micros, alors que 194 impulsions sont suffisantes pour éliminer les plus sensibles, S sanguis et   P nigrescens.  

En ce qui concerne P. nigrescens cette sensibilité pourrait s’expliquer du fait de son caractère anaérobie  strict. Toutes les opérations de préparation canalaire ont tendance à l’exposer à l’air ambiant favorisant  certainement une oxygénation de la suspension.  

 Ce phénomène ne peut pourtant pas être mis en cause dans le cas de S sanguis, aéro-anaérobie. WHITTERS et   al. [61 ont utilisé, en mode continu, un laser Nd-YAG avec une énergie de 120mJ à 15Hz et un temps   opératoire de 3 mn. (ie 2700 impulsions) soit une énergie totale de 21,6 J. Ils obtiennent une réduction   de 99,9% du nombre des bactéries. En adoptant un protocole opératoire semblable, avec un laser Nd-   YAP, la lyse des bactéries endocanalaires testées est également obtenue mais avec une énergie   beaucoup plus faible (1,98 J). Le temps opératoire est plus court et le nombre d’impulsions est réduit. Les résultats   semblent démontrer qu’il est possible avec un laser Nd-YAP d’éliminer les bactéries d’origine canalaire. Il   n’est toutefois pas possible d’avancer qu’in vivo l’antisepsie des atteintes infectieuses canalaires puisse être   obtenue aussi facilement.  

Certes le volume maximal d’un canal ne dépasse pas quelques NI alors que l’expérimentation a été effectuée sur 50 NI de  suspension. Mais l’anatomie canalaire est complexe. Les bactéries colonisent la totalité du réseau canalaire  radiculaire [3] et certaines pénètrent dans les tubuli [16j. Confinées dans ces zones peu accessibles à l’action  directe du faisceau laser, il est possible que certaines résistent à ce type de traitement. Les travaux de HARDEE et al [10j  semblent le confirmer; avec un laser Nd-YAG ils n’obtiennent pas d’action significative sur des canaux ensemencés  avec les spores de B. sfearothermophilius. D’autres études sur dents naturelles doivent donc être menées pour  confirmer ces premiers résultats encourageants.  

Avec un laser â fibre le dégagement thermique à l’extrémité de la fibre est très important. Il est en effet  possible de provoquer une fusion de l’apatite. Il s’agit toutefois d’une élévation de température très  ponctuelle. Pour traiter la totalité de la suspension, l’opérateur déplace, au cours des tirs, l’extrémité de la  fibre. Ainsi à la surface de la racine l’élévation de température reste modérée et est en moyenne de 25,4°C.  Ces élévations de température associées à une absorption du faisceau par les structures péri-radiculaires  peuvent provoquer toutefois des lésions tissulaires.  

Bahcall et al. [17j ont décrit les effets qui survenaient au niveau des tissus de soutien, après l’utilisation d’un  laser Nd-YAG. Des préparations canalaires ont été effectuées sur des prémolaires de chien à une énergie de  3W/25 Hz. Les réactions tissulaires ont été observées par examen radiographique et histologique. Le  traitement des canaux avec le laser provoque une lyse des cellules du ligament au bout de 24h, des  résorptions osseuses après 15 jours et à un mois des zones d’ankylose, des destructions cémentaires et de  profonds remaniements osseux. Miserendino et al [18] ont montré que des altérations tissulaires peuvent se  produire avec des élévations de température supérieures â 21′>C. Il s’agit de destruction cellulaire par  dénaturation des enzymes cellulaires et des structures des protéines. Toutefois, si l’irradiation est brève et  l’élévation de température inférieure à 30°C, les lésions engendrées ne devraient pas être irréversibles.  C’est le cas avec le laser utilisé pour lequel le temps opératoire de 28 s limite l’élévation de température. De  plus, in vivo, la circulation sanguine, en jouant un rôle de régulation thermique, diminue légèrement ce  phénomène.  

Avec le laser testé, si les caractéristiques de tirs nécessaires pour éliminer les bactéries dans les tubes  Ependorf sont utilisées, l’élévation de température dans la dent reste modérée. Il semble toutefois,  nécessaire de vérifier in vivo ce phénomène. L’élimination complète des bactéries à l’intérieur du réseau  canalaire complexe pourrait nécessité plus d’énergie entraînant une brève élévation de température dans le  ligament parodontal. 

 

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LÉGENDES  

Fig t : Schéma du montage du protocole expérimental 

Tab t : Moyenne des dures d’irradiation, du nombre d’impulsions et du nombre d’unités formant colonie en fonction de la  température relevée la surface du tube et des différentes souches bactériennes.  

Tab 2 . Températures en degrés °C relevées la surface radiculaires de 10 dents monoradiculées après une irradiation de 28″ ou  350 impulsions (d=dent ; Moy=moyenne des 10 essais) et élévation moyenne de température (EMT).